SARS-ORF1ab/RdRP Pseudovirus Standard Reference

Severe acute respiratory syndrome (SARS)于2003年二月在亚洲第一次被报道，继而传播到全球十几个国家，SARS属于一种冠状病毒，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，对应的结构示意图如下：

根据CDC和WHO的介绍，针对  SARS的核酸诊断一般是针对ORF1ab/RdRP(RNA-dependent RNA polymerase)、Gene N、Gene M和Gene E， Gene S更多用于对应药物和疫苗的开发。NCBI收录序列为NC_004718.3，全长29751bp，基因编码4个结构蛋白：S，M，N和E。

试剂盒的检测限问题，是造成假阴性的最大根源，因此针对诊断产品的检测限，我们需要认真做每款试剂盒的性能评价。以往针对检测限的性能评价，一般是选择体外转录的RNA、或者临床阳性病毒来作为标准品，用于性能评价。但是两者都具有很明显的确定，首先体外转录的RNA，一般是很纯，单一，不涉及提取，不符合临床病毒的微环境，因此必然造成检测灵敏度被高估，这也是存在高概率假阴性的主要原因；再次临床阳性病毒，即使是灭活的病毒，也是存在很大的生物安全隐患，因此要求实验室级别为P3-P4，大部分开发诊断试剂盒单位都不满足改要求，另外临床阳性病毒也是来源很有限，不能被稳定供应，反复用于试剂盒的  性能评价。

有病毒的完整包膜结构，有SARS对应的核酸序列，但是生物安全风险较低的假病毒标准品，完美的克服了选择体外转录的RNA、或者临床阳性病毒来作为标准品的缺点，非常适合用于核酸诊断性能评价的标准品。

构建过程：SARS基因合成→假病毒包装→纯化→QC检测（ddPCR）

ORF1ab/RdRP（2795bp）

• 根据SARS冠状病毒的特点，选取了ORF1ab/RdRP（RNA-dependent RNA polymerase）、Gene E(envelope protein)、Gene N(nucleocapsid phosphoprotein)、Gene M合计4个区段的序列，用于假病毒的包装，4个区段很好的表征了SARS的特征序列；

• 304am永利集团设计了ddPCR体系的引物、探针序列，可不需要构建标准曲线的前提下完成对假病毒的QC拷贝数检测，非常准确表征标准品的拷贝数，而且克服了Q-PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性；

• 假病毒标准品，无致病性，可再生，质控方法可靠，批次间稳定，可以长期稳定制备和供应，而且要求实验室生物安全级别为P2，满足很多单位的安全需求。

ORF1ab/RdRP:

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