DDPCR检测

▏ 服务原理

研究PCR技术从1983年开始依次经历普通PCR，Real-Time PCR和dPCR，现如今dPCR技术的发展就像1990年代末的Real-Time PCR发展一样，发展迅猛。
下面我们以DdPCR为例，讨论dPCR技术。

什么是DdPCR? 有什么技术特征？有哪些方面的应用？
DdPCR全称Droplet Digital PCR，引用bio-rad的描述为Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.



从基本原理我们不难看出，DdPCR最大的优点是绝对定量，表现为：

· 绝对定量 -ddPCR技术无需输入标准曲线即可提供每个输入样品的目标DNA拷贝的绝对计数,使该技术非常适合目标DNA的测量，病毒载量分析和微生物定量；
· 较高的精确度 – ddPCR提供的大量样品分配功能可以可靠地测量样品中靶DNA序列拷贝数的微小差异；
· 提高信噪比 -稀释高拷贝模板和背景，有效富集靶标阳性分区中的模板浓度，从而可以灵敏地检测稀有靶标，并实现±10％的定量精度，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001%；
· 消除PCR偏差 -消除qPCR的扩增效率依赖性，降低了错误率，可检测到小的（1.2倍）差异，这里需要指出的是；
· 降低了耗材成本 -反应体积在皮升至纳升的范围内，减少了试剂的使用和每个数据点所需的样品量，对于珍贵的样品尤其适用；
· 降低设备成本 -基于乳液的反应系统意味着PCR反应可以在标准的热循环仪中进行，而无需复杂的芯片或微流体。
· 出色的分区 -ddPCR技术每20 µl样品可产生20,000个液滴，在96孔板上可进行近200万个分区PCR反应，分区数量越多，精度越高。

▏ 服务应用

DdPCR技术有很多方面的应用，我们按照发表文章的领域，可以简单划分为：



结合肿瘤领域，我们一般与之相关的有4个领域的应用：
1. 检测Gene Expression，主要是检测mRNA的定量分析；
2. 检测Mutation（SNV和Indel），可以检测拷贝数，也可以检测比率；
3. 检测CNV（拷贝数变异分析），相对定量；
4. 检测Fusion，可以检测拷贝数，也可以检测比率；

▏ 案例展示

 同样的，304am永利集团也针对这4个应用开发对应的检测试剂盒，配套304am永利集团的参考品，对试剂盒做性能评价，如下我们以EGFR T790M为例：
实验一：灵敏度测试

待测样本：不同%AF的EGFR T790M的标准品，依次为5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%。

首先我们选择50%的EGFR T790M标准品(CBP10402)，该标准品是通过基因编辑，二等位基因，CN=2，编辑一条为mutation，一条为WT，经过理论值计算、Sanger测序、Bio-Rad DdPCR试剂盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同验证，确认为50%的频率。然后使用对应的host cell的gDNA，按照质量比（Qubit 3.0 三次定量取平均）有限稀释到5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%，每个样本准备3个重复，合计18个样本同一次实验检测对应的频率。

对应的数据为：


由以上数据可见，EGFR T790M检测体系，对于0.1%都是能检出，且符合标准，但是波动比较大。另外实验过程中，我们发现虽然DdPCR理论上可以生成20000个液滴，但是多次实验表明，实际生成往往是低于这个数值，平均约为8000-10000个，液滴数越少，因此低于0.1%的频率可能会波动很大，影响真实值判断。

实验二：重复性测试

待测样本：取1%和0.1%的EGFR T790M的标准品，分成8份，每份上样10ng，一次实验完成对应的定标。

对应的数据为：



由以上数据可见，EGFR T790M检测体系是稳定可重复的，全部能检出。

同样的我们也对Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion开发了部分DdPCR试剂盒，利用304am永利集团特有的标准品产品，我们做了性能评价，陆续上线了多款产品，如下是我们已经上线的DdPCR探针、引物的清单，全部在QX200上验证过：

更多的DdPCR产品可以选择304am永利集团开发定制，我们不仅可以开发定制探针、引物，我们还有标准品用于验证体系性能评价。